La proteïna és un component essencial de tots els organismes. Cadascuna de les seves molècules està formada per una o més cadenes polipeptídiques formades per aminoàcids. Tot i que la informació necessària per a la vida està codificada en l'ADN o l'ARN, les proteïnes recombinants realitzen una àmplia gamma de funcions biològiques en els organismes, incloent catàlisi enzimàtica, protecció, suport, moviment i regulació. Segons les seves funcions en el cos, aquestes substàncies es poden dividir en diferents categories, com ara anticossos, enzims, component estructural. Donades les seves importants funcions, aquests compostos s'han estudiat intensament i s'han utilitzat àmpliament.
Antigament, la principal manera d'obtenir una proteïna recombinant era aïllar-la d'una font natural, que sol ser ineficient i requereix molt de temps. Els avenços recents en tecnologia biològica molecular han permès clonar l'ADN que codifica un conjunt específic de substàncies en un vector d'expressió de substàncies com ara bacteris, llevats, cèl·lules d'insectes i cèl·lules de mamífers.
En poques paraules, les proteïnes recombinants es tradueixen mitjançant productes d'ADN exògens acèl·lules vives. Aconseguir-los sol implica dos passos principals:
- Clonació d'una molècula.
- Expressió de proteïnes.
Actualment, la producció d'aquesta estructura és un dels mètodes més potents utilitzats en medicina i biologia. La composició té una àmplia aplicació en recerca i biotecnologia.
Direcció mèdica
Les proteïnes recombinants proporcionen tractaments importants per a diverses mal alties com la diabetis, el càncer, les mal alties infeccioses, l'hemofília i l'anèmia. Les formulacions típiques d'aquestes substàncies inclouen anticossos, hormones, interleucines, enzims i anticoagulants. Hi ha una necessitat creixent de formulacions recombinants per a ús terapèutic. Us permeten ampliar els mètodes de tractament.
Les proteïnes recombinants modificades genèticament tenen un paper clau en el mercat de medicaments terapèutics. Les cèl·lules de mamífers produeixen actualment els agents més terapèutics perquè les seves formulacions són capaços de produir substàncies naturals d' alta qualitat. A més, moltes proteïnes terapèutiques recombinants aprovades es produeixen a E. coli a causa d'una bona genètica, un creixement ràpid i una alta productivitat. També té un efecte positiu en el desenvolupament de fàrmacs basats en aquesta substància.
Recerca
L'obtenció de proteïnes recombinants es basa en diferents mètodes. Les substàncies ajuden a conèixer els principis bàsics i fonamentals del cos. Aquestes molècules es poden utilitzar per identificar i determinarubicació de la substància codificada per un gen concret i revelar la funció d' altres gens en diverses activitats cel·lulars, com ara la senyalització cel·lular, el metabolisme, el creixement, la replicació i la mort, la transcripció, la traducció i la modificació dels compostos tractats a l'article..
Per tant, la composició observada s'utilitza sovint en biologia molecular, biologia cel·lular, bioquímica, estudis estructurals i biofísics i molts altres camps de la ciència. Al mateix temps, l'obtenció de proteïnes recombinants és una pràctica internacional.
Aquests compostos són eines útils per entendre les interaccions intercel·lulars. Han demostrat ser efectius en diversos mètodes de laboratori com ELISA i immunohistoquímica (IHC). Les proteïnes recombinants es poden utilitzar per desenvolupar assajos enzimàtics. Quan s'utilitzen en combinació amb un parell d'anticossos adequats, les cèl·lules es poden utilitzar com a estàndards per a noves tecnologies.
Biotecnologia
Les proteïnes recombinants que contenen una seqüència d'aminoàcids també s'utilitzen a la indústria, la producció d'aliments, l'agricultura i la bioenginyeria. Per exemple, en la ramaderia, es poden afegir enzims als aliments per augmentar el valor nutricional dels ingredients dels pinsos, reduir costos i residus, donar suport a la salut intestinal dels animals, millorar la productivitat i millorar el medi ambient.
A més, els bacteris làctics (LAB) durant molt de tempss'han utilitzat per produir aliments fermentats, i recentment s'ha desenvolupat LAB per a l'expressió de proteïnes recombinants que contenen una seqüència d'aminoàcids, que es poden utilitzar àmpliament, per exemple, per millorar la digestió humana, animal i nutricional.
No obstant això, aquestes substàncies també tenen limitacions:
- En alguns casos, la producció de proteïnes recombinants és complexa, costosa i requereix molt de temps.
- És possible que les substàncies produïdes a les cèl·lules no coincideixin amb les formes naturals. Aquesta diferència pot reduir l'eficàcia de les proteïnes recombinants terapèutiques i fins i tot provocar efectes secundaris. A més, aquesta diferència pot afectar els resultats dels experiments.
- El principal problema de tots els fàrmacs recombinants és la immunogenicitat. Tots els productes biotecnològics poden presentar algun tipus d'immunogenicitat. És difícil predir la seguretat de les noves proteïnes terapèutiques.
En general, els avenços en biotecnologia han augmentat i han facilitat la producció de proteïnes recombinants per a una varietat d'aplicacions. Tot i que encara tenen alguns inconvenients, les substàncies són importants en medicina, recerca i biotecnologia.
Enllaç a la mal altia
La proteïna recombinant no és perjudicial per als humans. Només és una part integral de la molècula global en el desenvolupament d'un determinat fàrmac o element nutricional. Molts estudis mèdics han demostrat que l'expressió forçada de la proteïna FGFBP3 (abreujada BP3) en una soca de laboratori de ratolins obesos va mostrar una reducció significativa del greix corporal.massa, malgrat la predisposició genètica a l'ús.
Els resultats d'aquests assaigs mostren que la proteïna FGFBP3 pot oferir una nova teràpia per als trastorns associats a la síndrome metabòlica com la diabetis tipus 2 i la mal altia del fetge gras. Però com que BP3 és una proteïna natural i no un fàrmac artificial, els assaigs clínics de BP3 humà recombinant podrien començar després de la ronda final d'estudis preclínics. En, és a dir, hi ha raons relacionades amb la seguretat de realitzar aquests estudis. La proteïna recombinant no és perjudicial per als humans a causa del seu processament i purificació gradual. També s'estan produint canvis a nivell molecular.
PD-L2, un dels actors clau de la immunoteràpia, va ser nominat al Premi Nobel de Fisiologia o Medicina 2018. Aquest treball, iniciat pel professor James P. Allison dels EUA i el professor Tasuku Honjo del Japó, ha donat lloc al tractament de càncers com el melanoma, el càncer de pulmó i altres basats en la immunoteràpia de control. Recentment, AMSBIO ha afegit un important nou producte a la seva línia d'immunoteràpia, l'activador PD-L2/TCR - CHO Recombinant Cell Line.
En experiments de prova de concepte, investigadors de la Universitat d'Alabama a Birmingham, dirigits per H. Long Zheng, MD, el professor Robert B. Adams i el director de Medicina de Laboratori, Departament de Patologia de l'Escola de Medicina de la UAB Medicina, han posat de relleu una possible teràpia, un trastorn hemorràgic rar però mortal, el TTP.
Els resultats d'aixòels estudis demostren per primera vegada que la transfusió de plaquetes carregades amb rADAMTS13 pot ser un enfocament terapèutic nou i potencialment eficaç per a la trombosi arterial associada a la TTP congènita i mediada per la immunitat.
La proteïna recombinant no només és un nutrient, sinó també un fàrmac en la composició del fàrmac que s'està desenvolupant. Aquests són només alguns àmbits que ara estan implicats en la medicina i relacionats amb l'estudi de tots els seus elements estructurals. Com mostra la pràctica internacional, l'estructura d'una substància fa possible a nivell molecular fer front a molts problemes greus del cos humà.
Desenvolupament de vacunes
Una proteïna recombinant és un conjunt específic de molècules que es poden modelar. Una propietat similar s'utilitza en el desenvolupament de vacunes. Una nova estratègia de vacunació, també coneguda com l'ús d'una injecció especial de virus recombinant, podria protegir milions de pollastres en risc d'una mal altia respiratòria greu, van dir investigadors de la Universitat d'Edimburg i l'Institut Pirbright. Aquestes vacunes utilitzen versions inofensives o febles d'un virus o bacteri per introduir gèrmens a les cèl·lules del cos. En aquest cas, els experts van utilitzar virus recombinants amb diferents proteïnes d'espiga com a vacunes per crear dues versions d'un virus inofensiu. Hi ha moltes drogues diferents construïdes al voltant d'aquesta connexió.
Els noms comercials i anàlegs de proteïnes recombinants són els següents:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Són principalment fàrmacs anticancerígens, però hi ha altres àrees de tractament associades amb aquesta substància activa.
Una nova vacuna, també anomenada LASSARAB, dissenyada per protegir les persones contra la febre de Lassa i la ràbia, ha mostrat resultats prometedors en estudis preclínics, segons un nou estudi publicat a la revista científica Nature Communications. Una vacuna recombinant candidata inactivada utilitza un virus de la ràbia debilitat.
L'equip d'investigació va inserir material genètic del virus de Lassa en un vector del virus de la ràbia perquè la vacuna expressés proteïnes superficials tant a les cèl·lules de Lassa com de la ràbia. Aquests compostos superficials provoquen una resposta immune contra agents infecciosos. Aleshores, aquesta vacuna es va inactivar per "destruir" el virus viu de la ràbia utilitzat per fer el portador.
Obtenció de mètodes
Hi ha diversos sistemes per produir una substància. El mètode general per obtenir una proteïna recombinant es basa en l'obtenció de material biològic a partir de la síntesi. Però hi ha altres maneres.
Actualment hi ha cinc sistemes d'expressió principals:
- Sistema d'expressió d'E. coli.
- Sistema d'expressió de llevat.
- Sistema d'expressió de cèl·lules d'insectes.
- Sistema d'expressió de cèl·lules de mamífers.
- Sistema d'expressió de proteïnes sense cèl·lules.
L'última opció és especialment adequada per a l'expressió de proteïnes transmembranai compostos tòxics. En els darrers anys, s'han integrat amb èxit a les cèl·lules in vitro substàncies difícils d'expressar mitjançant mètodes intracel·lulars convencionals. A Bielorússia, la producció de proteïnes recombinants s'utilitza àmpliament. Hi ha diverses empreses estatals que tracten aquest problema.
Cell Free Protein Synthesis System és un mètode ràpid i eficaç per sintetitzar substàncies diana afegint diversos substrats i compostos energètics necessaris per a la transcripció i traducció al sistema enzimàtic dels extractes cel·lulars. En els darrers anys, els avantatges dels mètodes lliures de cèl·lules per a tipus de substàncies com les membranes complexes i tòxiques han sorgit gradualment, demostrant la seva aplicació potencial en el camp biofarmacèutic.
La tecnologia sense cèl·lules pot afegir una varietat d'aminoàcids no naturals fàcilment i de manera controlada per aconseguir processos de modificació complexos que són difícils de resoldre després de l'expressió recombinant convencional. Aquests mètodes tenen un alt valor d'aplicació i potencial per al lliurament de fàrmacs i el desenvolupament de vacunes mitjançant partícules semblants a virus. Un gran nombre de proteïnes de membrana s'han expressat amb èxit en cèl·lules lliures.
Expressió de composicions
La proteïna recombinant CFP10-ESAT 6 es produeix i s'utilitza per crear vacunes. Aquest al·lèrgen de tuberculosi us permet enfortir el sistema immunitari i desenvolupar anticossos. En general, els estudis moleculars impliquen l'estudi de qualsevol aspecte d'una proteïna, com ara l'estructura, la funció, les modificacions, la localització o les interaccions. Per explorarCom les substàncies específiques regulen els processos interns, els investigadors solen requerir els mitjans per produir compostos funcionals d'interès i benefici.
Donada la mida i la complexitat de les proteïnes, la síntesi química no és una opció viable per a aquest esforç. En canvi, les cèl·lules vives i la seva maquinària cel·lular s'utilitzen normalment com a fàbriques per crear i construir substàncies basades en les plantilles genètiques proporcionades. Aleshores, el sistema d'expressió de proteïnes recombinants genera l'estructura necessària per crear un fàrmac. A continuació ve la selecció del material necessari per a diferents categories de medicaments.
A diferència de les proteïnes, l'ADN és fàcil de construir sintèticament o in vitro mitjançant tècniques recombinants ben establertes. Per tant, les plantilles d'ADN de gens específics, amb o sense seqüències informadores afegides o seqüències d'etiquetes d'afinitat, es poden dissenyar com a plantilles per a l'expressió de la substància monitoritzada. Aquests compostos derivats d'aquestes plantilles d'ADN s'anomenen proteïnes recombinants.
Les estratègies tradicionals per a l'expressió d'una substància impliquen la transfecció de cèl·lules amb un vector d'ADN que conté una plantilla i després el cultiu de les cèl·lules per transcriure i traduir la proteïna desitjada. Normalment, les cèl·lules es lisen per extreure el compost expressat per a la purificació posterior. La proteïna recombinant CFP10-ESAT6 es processa d'aquesta manera i passa per un sistema de purificació de possiblesla formació de toxines. Només després d'això es sintetitzarà en una vacuna.
S'utilitzen àmpliament sistemes d'expressió in vivo per a substàncies moleculars tant procariotes com eucariotes. L'elecció del sistema depèn del tipus de proteïna, el requisit d'activitat funcional i el rendiment desitjat. Aquests sistemes d'expressió inclouen mamífers, insectes, llevats, bacteris, algues i cèl·lules. Cada sistema té els seus propis avantatges i reptes, i escollir el sistema adequat per a una aplicació concreta és important per a l'expressió correcta de la substància a revisar.
Expressió dels mamífers
L'ús de proteïnes recombinants permet el desenvolupament de vacunes i fàrmacs de diversos nivells. Per a això, es pot utilitzar aquest mètode d'obtenció d'una substància. Els sistemes d'expressió de mamífers es poden utilitzar per produir proteïnes del regne animal que tenen l'estructura i activitat més natives a causa del seu entorn fisiològicament rellevant. Això es tradueix en alts nivells de processament post-traduccional i activitat funcional. Els sistemes d'expressió de mamífers es poden utilitzar per produir anticossos, proteïnes complexes i compostos per utilitzar-los en assajos funcionals basats en cèl·lules. Tanmateix, aquests avantatges s'acompanyen de condicions de cultiu més estrictes.
Els sistemes d'expressió de mamífers es poden utilitzar per generar proteïnes de manera transitòria o mitjançant línies cel·lulars estables on la construcció d'expressió s'integra al genoma de l'hoste. Tot i que aquests sistemes es poden utilitzar en múltiples experiments, el tempsla producció pot generar una gran quantitat de substància en una o dues setmanes. Aquest tipus de biotecnologia de proteïnes recombinants té una gran demanda.
Aquests sistemes d'expressió de mamífers transitoris i d' alt rendiment utilitzen cultius en suspensió i poden produir grams per litre. A més, aquestes proteïnes tenen més plegament natiu i modificacions post-traduccionals com la glicosilació en comparació amb altres sistemes d'expressió.
Expressió d'insecte
Els mètodes per produir proteïnes recombinants no es limiten als mamífers. També hi ha maneres més productives pel que fa als costos de producció, tot i que el rendiment d'una substància per 1 litre de líquid tractat és molt inferior.
Les cèl·lules d'insectes es poden utilitzar per expressar una proteïna d' alt nivell amb modificacions similars als sistemes de mamífers. Hi ha diversos sistemes que es poden utilitzar per generar baculovirus recombinant, que després es poden utilitzar per extreure la substància d'interès de les cèl·lules d'insectes.
Les expressions de proteïnes recombinants es poden ampliar i adaptar fàcilment al cultiu de suspensió d' alta densitat per a la combinació de molècules a gran escala. Funcionalment són més semblants a la composició nativa de la matèria dels mamífers. Tot i que el rendiment pot ser de fins a 500 mg/L, la producció de baculovirus recombinant pot consumir molt de temps i les condicions de cultiu són més difícils que els sistemes procariotes. No obstant això, als països més del sud i més càlids, una semblantel mètode es considera més eficient.
Expressió bacteriana
La producció de proteïnes recombinants es pot establir amb l'ajuda de bacteris. Aquesta tecnologia és molt diferent de les descrites anteriorment. Els sistemes d'expressió de proteïnes bacterianes són populars perquè els bacteris són fàcils de cultivar, creixen ràpidament i donen alts rendiments de la formulació recombinant. Tanmateix, les substàncies eucariotes multidomini expressades en bacteris sovint no són funcionals perquè les cèl·lules no estan equipades per dur a terme les modificacions posteriors a la traducció o el plegament molecular necessaris.
A més, moltes proteïnes es tornen insolubles com a molècules d'inclusió, que són molt difícils de recuperar sense desnaturalitzadors durs i els procediments de replegament moleculars complicats posteriors. Es considera principalment que aquest mètode encara és en gran mesura experimental.
Expressió lliure de cèl·lules
La proteïna recombinant que conté la seqüència d'aminoàcids de l'estafilocinasa s'obté d'una manera lleugerament diferent. S'inclou en molts tipus d'injeccions i requereixen diversos sistemes abans d'utilitzar-lo.
L'expressió de proteïnes lliures de cèl·lules és una síntesi in vitro d'una substància mitjançant extractes de cèl·lules senceres compatibles amb la traducció. En principi, els extractes de cèl·lules senceres contenen totes les macromolècules i components necessaris per a la transcripció, la traducció i fins i tot la modificació posterior a la traducció.
Aquests components inclouen l'ARN polimerasa, els factors reguladors de proteïnes, les formes de transcripció, els ribosomes i l'ARNt. En afegircofactors, nucleòtids i una plantilla gènica específica, aquests extractes poden sintetitzar proteïnes d'interès en poques hores.
Tot i que no són sostenibles per a la producció a gran escala, els sistemes d'expressió de proteïnes in vitro o sense cèl·lules (IVT) ofereixen una sèrie d'avantatges respecte als sistemes convencionals in vivo.
L'expressió lliure de cèl·lules permet la síntesi ràpida de formulacions recombinants sense implicar cultiu cel·lular. Els sistemes lliures de cèl·lules permeten marcar proteïnes amb aminoàcids modificats, així com expressar compostos que pateixen una degradació proteolítica ràpida per proteases intracel·lulars. A més, és més fàcil expressar moltes proteïnes diferents al mateix temps mitjançant un mètode lliure de cèl·lules (per exemple, provant mutacions de proteïnes mitjançant l'expressió a petita escala de moltes plantilles d'ADN recombinant diferents). En aquest experiment representatiu, es va utilitzar el sistema IVT per expressar la proteïna caspasa-3 humana.
Conclusions i perspectives de futur
La producció de proteïnes recombinants ara es pot veure com una disciplina madura. Aquest és el resultat de nombroses millores incrementals en la purificació i l'anàlisi. Actualment, els programes de descoberta de fàrmacs poques vegades s'aturen a causa de la incapacitat de produir la proteïna diana. Els processos paral·lels per a l'expressió, purificació i anàlisi de diverses substàncies recombinants són avui ben coneguts en molts laboratoris d'arreu del món.
Complexes de proteïnes i èxit creixent en la fabricacióLes estructures de membrana solubilitzades requeriran més canvis per mantenir-se al dia amb la demanda. L'aparició d'organitzacions efectives de recerca per contracte per a un subministrament més regular de proteïnes permetrà la reassignació de recursos científics per fer front a aquests nous reptes.
A més, els fluxos de treball paral·lels haurien de permetre la creació de biblioteques completes de la substància supervisada per permetre la identificació de nous objectius i la detecció avançada, juntament amb els projectes tradicionals de descobriment de fàrmacs amb molècules petites.
