Els microorganismes de la natura que ens envolten estan a tot arreu: en sòls, masses d'aigua, a la superfície de diversos objectes, hi habiten persones i animals. Tot això pot servir com a fonts de contaminació microbiana d'aliments, medicaments i línies de producció. El cultiu de bacteris és necessari per estudiar-ne les propietats, necessitats i característiques. Aquest, al seu torn, és un pas important en el desenvolupament de diversos fàrmacs, el diagnòstic de laboratori de mal alties, el càlcul de reactors de producció i molt més.
Conceptes generals
El cultiu de bacteris en microbiologia fa referència al cultiu de microorganismes realitzat al laboratori. Al seu torn, els microbis que han crescut en un medi nutritiu seleccionat s'anomenen cultiu. Els cultius es poden barrejar si estan formats per diferents tipus de microorganismes, i purs si només estan representats per un tipus de bacteris.
Si és nutritiuNomés es col·loca una cèl·lula al medi, i com a resultat de la seva reproducció s'obté un grup d'individus, llavors aquest conjunt de microorganismes s'anomena clon. Quan un clon es desenvolupa fins al punt que es fa visible a ull nu, aquesta col·lecció de bacteris s'anomena colònia.
En general, el cultiu de bacteris aïllats de diferents fonts es porta a terme per separat els uns dels altres. Cada grup de microbis cultivats per separat s'anomena soca. Així, si un tipus d'estafilococ s'aïlla de tres fonts (o porcions diferents del mateix producte, persones diferents), parlen de tres soques d'aquest tipus d'estafilococ.
Factors de creixement de bacteris
Aquests inclouen diversos aminoàcids, lípids, bases puríniques i altres compostos necessaris per al desenvolupament de microorganismes. Alguns microbis poden produir de manera independent les substàncies que necessiten, mentre que altres necessiten rebre-les en forma acabada. Segons les necessitats dels microorganismes en determinats factors de creixement, es realitza la identificació i diferenciació de bacteris. A més, aquest paràmetre és important per a la correcta preparació d'un medi nutritiu per a treballs de laboratori i biotecnològics:
- Aminoàcids. Els bacteris poden requerir un aminoàcid o grup d'àcids en particular. Per tant, els clostridis necessiten leucina i tirosina, els estreptococs necessiten leucina i arginina. Els microorganismes que necessiten aminoàcids de l'exterior per créixer s'anomenen auxòtrofs.
- Bases purines i pirimidiniques, així com els seus derivats (adenina, guanina i altres). Són un factor important en el creixement de moltsEspècie d'estreptococ.
- Vitamines. Formen part dels coenzims que necessiten els bacteris. Per tant, l'àcid nicotínic, així com la seva amida, que formen part del NAD i del NADP, són necessaris per la diftèria i els corinebacteris de Shigella. La tiamina, com a part integral del pirofosfat, és necessària per Staphylococcus aureus, pneumococ i brucella. L'àcid pantotènic, que forma part del coenzim CoA, és necessari pels bacils del tètanus i per certs tipus d'estreptococs. Els citocroms, i per tant l'àcid fòlic, els hemes i la biotina que els formen, són necessaris per a Mycobacterium tuberculosis i Haemophilus influenzae.
Requisits mediambientals
Condicions per als medis de cultiu per al cultiu de bacteris:
- Nutrició. Han de contenir substàncies, a més, en forma de fàcil digestió, necessàries perquè els microorganismes s'alimentin i reposin l'energia. Aquests inclouen orgànics i minerals. Alguns microorganismes també necessiten vitamines i aminoàcids que no poden sintetitzar.
- Nivell de pH òptim. Afecta la permeabilitat de la membrana cel·lular i, en conseqüència, la capacitat d'absorció de nutrients per part del bacteri. Molt sovint, el valor del pH hauria d'estar al nivell de 7, 2–7, 4. Molts microorganismes al llarg de la seva vida produeixen productes amb reaccions àcides o alcalines i perquè el pH del medi nutritiu no canviï, s'ha d'emmagatzemar a la memòria intermèdia.
- Isotònic. La pressió osmòtica en el medi nutritiu per al cultiu de bacteris ha de tenir els mateixos valors quedins de les cèl·lules microbianes. Normalment correspon a una solució de NaCl al 0,5%.
- Esterilitat. Això es deu al fet que l'aparició de bacteris estrangers distorsionarà els resultats de l'estudi de la soca analitzada.
- Nivell d'humitat. Aquest indicador, juntament amb la consistència del medi, hauria de tenir característiques òptimes per a un tipus concret de bacteris.
- Potencial redox (RH2). Mostra la proporció de substàncies que donen i accepten electrons, així com el nivell de saturació d'oxigen del medi nutritiu. Per als aerobis i anaerobis, les condicions per al cultiu de bacteris difereixen una mica en aquest indicador. Els microorganismes anaeròbics es reprodueixen millor amb valors RH2 inferiors a 5 i els microorganismes aeròbics com a mínim 10.
- Uniformitat. És important que el medi de cultiu contingui quantitats constants dels seus ingredients individuals. A més, es prefereixen solucions clares, que faciliten el seguiment del creixement dels cultius o l'observació de la contaminació.
Tipus de suports de cultiu
L'elecció d'un medi determinat per al cultiu de microorganismes està influenciada per molts factors, entre els quals destaquen les característiques de la seva nutrició i la finalitat de l'estudi. Les principals característiques subjacents a la classificació dels medis nutritius són:
1. Components. Segons les substàncies inicials utilitzades per crear el substrat, es distingeixen:
- naturals, que s'elaboren a partir de productes d'origen animal o vegetal (per exemple, carn, llet, fruita) i són aptes per al cultiu mixtcultius;
- semisintètics, en què els productes alimentaris naturals cars es substitueixen per productes no alimentaris (per exemple, farina d'os, coàguls de sang) i que són òptims per cultivar certs tipus de bacteris o aïllar els seus productes metabòlics del medi ambient;
- sintètics, que es preparen a partir de quantitats precises de compostos químics, tenen una composició constant coneguda i són fàcilment reproduïbles.
2. Consistència (densitat). Distingeix entorns:
- líquid;
- dens;
- semilíquid.
Els dos últims es preparen a partir de solucions especials o substàncies líquides amb l'addició d'agar-agar o gelatina per crear la densitat requerida. A més, un entorn dens per al creixement de bacteris és el sèrum de sang coagulada, patates, gel de sílice, carragenina.
3. Compost. Sobre aquesta base, els entorns són:
- simple, la llista de les quals és curta és Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), gelatina nutritiva i aigua de peptona.
- complex, preparat a partir de senzills amb l'addició de sang, sèrum de llet, hidrats de carboni i altres substàncies.
4. Cita. Es distingeixen els següents medis nutritius:
- main s'utilitzen per fer créixer molts microbis patògens (normalment composició simple);
- especials s'utilitzen per aïllar i cultivar bacteris que no creixen en substrats senzills;
- selectiu (també són selectius) són adequats per aïllar un tipus específic de bacteris i inhibir el creixement dels microbis associats (selectivitatcreat afegint determinades substàncies als mitjans, com ara antibiòtics o sals, o ajustant el pH);
- Els diagnòstics diferencials permeten distingir un tipus de bacteri d'un altre mitjançant l'avaluació de l'activitat enzimàtica, per exemple, del medi;
- conservants són necessaris per a la inoculació inicial amb el transport posterior de mostres, ja que eviten la mort de microorganismes, així com inhibeixen el creixement d' altres bacteris.
Els
Els
Preparació de mitjans
El pas més important en el cultiu de bacteris anaeròbics és la preparació d'un medi nutritiu adequat. Després de seleccionar els paràmetres òptims, procediu a les etapes següents:
- pesatge, seleccionant una mostra de components en una balança analítica;
- dissolució realitzada en aigua destil·lada escalfada a 70 °C, i els fosfats, les microsals i les macrosals es dissolen per separat;
- bullint al bany maria durant dos minuts;
- mitjançant paper indicador o potenciòmetre;
- filtració a través de filtres de paper o drap humit per a medis líquids i densos fosos, i a través d'un filtre de gasa de cotó per a medis d'agar;
- embotellat realitzat a 3/4 de capacitat;
- esterilització depenent mitjana;
- El control de l'esterilitat es realitza instal·lant durant dos dies en un termòstat, seguit de la visualització;
- control químic per establir el pH i el contingut dels necessarisarticles;
- control biològic mitjançant inoculació d'assaig.
Determinació del pH
Esterilització de cristalleria i suports
Un dels principis bàsics del cultiu bacterià és l'esterilitat. El creixement i desenvolupament de microorganismes estrangers poden afectar les característiques del medi nutritiu canviant-ne la composició química i el pH. L'esterilització és la condició principal per al creixement de cultius purs. A la pràctica, aquest terme significa els mètodes de destrucció de totes les formes de vida a la superfície i en el volum dels objectes esterilitzats. Els vasos, els instruments utilitzats, els suports i altres articles utilitzats durant l'estudi s'esteril·litzen.
Alguns tipus d'esterilització:
- Ignició. Esterilització de bucles i agulles per sembrar, portaobjectes de vidre, alguns instruments es poden fer amb un cremador o una làmpada d'alcohol.
- Ebullició. Adequat per manipular xeringues, agulles, aliments, però no mata les espores bacterianes.
- Esterilització per calor sec. Es realitza en un armari d'assecat especial i és adequat per processar matrassos, tubs d'assaig i altres objectes de vidre de laboratori.
- Esterilització amb vapor. Realitzat en autoclau, aquest mètode és molt eficaç. Però no és adequat per a medis nutritius que continguin proteïnes o qualsevol altre compost que es descomponda a altes temperatures. Més estalvi es pot anomenar tindalització. Es realitza a la caldera Koch i combina la germinació d'espores amb la seva destrucció.
- Pasteurització. S'utilitza per a mitjans que canvien les seves propietats quan es bullen (per exemple, llet, vi, cervesa), capaç dedesfer-los dels microorganismes que no porten espores. La temperatura de processament és de només 50-60 ° C durant quinze o trenta minuts. En alguns casos, s'utilitza l'esterilització en fred, realitzada mitjançant filtres o raigs UV.
Condicions de cultiu de bacteris
El creixement i desenvolupament de bacteris només és possible sota determinats factors i els valors de cadascun d'ells:
1. Temperatura. Hi ha tres grups de bacteris que difereixen en les preferències de temperatura:
- termòfils, o microbis amants de la calor, creixen entre 45 i 90 °C, el que significa que no es multipliquen en organismes humans i animals;
- psicròfils, o microorganismes amants del fred, prefereixen temperatures d'entre 5 i 15 °C i es cultiven a les cambres frigorífiques;
- mesòfils, es desenvolupen a una temperatura de 25-37 °C, inclouen la major part dels bacteris.
2. Llum. És una característica del cultiu de bacteris fototròfics, ja que realitzen el procés fotosintètic. Però per a la majoria de microbis, la il·luminació no és un requisit previ. I fins i tot a l'inrevés, l'ultraviolat solar pot suprimir el seu desenvolupament.
3. Aigua. Tots els microorganismes necessiten aigua en una forma accessible (líquida). És per això que els aliments congelats tenen poc o cap creixement de bacteris.
4. Acidesa del medi ambient. Aquest principi de cultiu de bacteris ja s'ha parlat amb detall més amunt.
5. Aireació. L'oxigen, com a element químic, és una part integral de l'aigua i s'utilitzen un nombre considerable de compostoscultiu de microorganismes. L'oxigen gasós també es pot contenir en aigua i altres líquids en forma dissolta. Una part important dels bacteris necessita un subministrament constant de molècules d'oxigen. Però per a una sèrie de microorganismes, és innecessari o, pitjor, l'oxigen gasós és tòxic per a ells, ja que no tenen catalasa i peroxidasa, que destrueixen els productes respiratoris tòxics. Per tant, el pas més important en el cultiu de bacteris anaeròbics és l'eliminació de molècules d'O2 del medi nutritiu.
6. Cultiu de microorganismes. El cultiu de bacteris aeròbics i anaeròbics es porta a terme en diferents capes del medi i en diferents modes.
Conreu de microorganismes aeròbics
El cultiu de bacteris aeròbics requereix oxigen molecular. Per obtenir cultius purs d'aerobis que es puguin utilitzar amb èxit en la medicina i la indústria alimentària, s'utilitzen els mètodes següents:
- superfície que creix en medis densos o líquids (la seva capa fina) quan l'oxigen prové directament de l'aire;
- cultiu profund en medis líquids, quan s'aconsegueix un augment de la quantitat d'oxigen dissolt en ells per aireació constant.
Conreu de microorganismes anaeròbics
El principi bàsic del cultiu de bacteris d'aquest tipus és el seu mínim contacte amb l'oxigen atmosfèric. Proporcionar condicions per al seu creixement és molt més difícil que per als aerobis. Els mètodes següents s'utilitzen per aïllar els anaerobis de l'O molecular2:
- Físic. Aquest mètode de cultiu de bacteris anaeròbics es redueix al seu cultiu en un aparell especial de buit: un microanaeròstat. L'aire que hi ha es substitueix per una barreja de gas especial de nitrogen amb l'addició d'un 10% d'hidrogen i un 5% de diòxid de carboni.
- Química. Aquests inclouen: ús d'agents absorbents (per exemple, Fe, Na2S2O4, CuCl) o agents reductors (com l'àcid ascòrbic).
- Biològic. Es redueix al co-cultiu d'aerobis i anaerobis en un sistema tancat. Aquest mètode de cultiu de bacteris consisteix a sembrar la meitat d'una placa de Petri amb algunes de les espècies aeròbiques de bacteris i l' altra meitat amb l'anaerobi estudiat. El seu desenvolupament començarà en el moment en què s'esgoti tot l'oxigen.
Els mètodes de sembra següents són adequats per al cultiu de bacteris anaeròbics:
- a la capa superficial;
- a la capa superficial plena de parafina estèril;
- en el gruix d'un medi nutritiu dens;
- en capes profundes de suports viscós.
Obtenció de cultura pura
Els microbiòlegs solen treballar amb mostres habitades per molts tipus diferents de microbis. Tanmateix, per determinar la posició sistemàtica dels microorganismes (família, gènere, espècie), així com per estudiar-ne les característiques, cal aïllar-los i fer créixer un cultiu pur. Són de gran importància en moltes indústries alimentàries, per exemple, formatges, pa, kvas, vi, etc. El cultiu de bacteris làctics permet obtenirun component essencial per a la producció de productes lactis fermentats, massa, cacau, ensitjat i fins i tot plàstic.
El mètode per aïllar un cultiu pur en un medi dens es basa en la separació mecànica de cèl·lules de microorganismes amb el seu posterior cultiu aïllat. La mostra es transfereix a un volum estèril d'aigua o solució salina (volum 10-100 ml) i després s'agita durant dos minuts. Per extreure els microorganismes localitzats en el gruix del material objecte d'estudi (per exemple, embotits o formatges), primer es frega les peces de mostra amb instruments estèrils amb sorra. El material que ha estat preparat prèviament, amb un pes d'1 g o un volum d'1 ml, es dilueix amb aigua estèril 10, 100, 1000, etc. vegades. S'escull el grau de dilució que dóna una concentració de cèl·lules corresponent a les capacitats del mètode.
El conreu posterior de microorganismes consisteix a preparar un medi nutritiu. Normalment es tria un medi dens (MPA). Primer es fon i es refreda a 45-50 ° C, i només després s'aboca en diverses plaques de Petri (de tres a cinc peces), a la part inferior de les quals es col·loquen hisops de la substància de prova de diverses concentracions. A continuació, es barreja el medi nutritiu encara no congelat i el material introduït en ell. Així és com es fixen les cèl·lules en diversos punts del volum del substrat.
A continuació, les plaques de Petri es col·loquen en un termòstat durant 2 dies a 22 °C. Durant aquest temps, les cèl·lules es multipliquen fins a tal punt que la colònia formada per cadascuna de les cèl·lules es fa visible a ull nu. Cadascun d'ells és un cultiu pur del tipus de bacteris de les cèl·lules dels quals procedeixrosa.
Després d'això, a partir de plaques de Petri, els microorganismes es subculten en tubs d'assaig separats plens d'un medi nutritiu. D'aquesta manera, s'aïllen cultius purs d'una mostra mixta. Aquest mètode porta el nom del seu desenvolupador: R. Koch. També s'anomena comunament el mètode de la copa, o la sembra d'esgotament. Després d'obtenir cultius purs de diversos tipus de bacteris, es determinen la seva forma, espores i famílies.
Tots els treballs s'han de realitzar seguint els principis d'asèpsia. Per evitar el desenvolupament prematur de microorganismes, l'estudi s'ha de dur a terme immediatament després del mostreig. L'aigua de l'aixeta s'analitza després de drenar les primeres porcions, ja que poden contenir microbis acumulats en canonades i aixetes. La microflora de fruites, baies i verdures es localitza principalment a la superfície (pela), per tant, se'n fan rentats. Per fer-ho, col·loqueu el fetus en un recipient estèril i ompliu-lo amb la quantitat d'aigua necessària. Després s'agiten amb força i s'aboca l'aigua en un altre recipient. Els cultius de productes de tela també s'obtenen en hisops, però abans se'n tallen peces d'una mida determinada.
