La tinció de Gram s'utilitza àmpliament en microbiologia, ja que és una de les maneres més fàcils de diferenciar els bacteris en funció de la composició de la seva paret cel·lular. Segons Gram, tots els bacteris es poden dividir en grampositius (Gram (+)) i gramnegatius (Gram (-)). El mètode de tinció de Gram es va desenvolupar l'any 1884 i no ha perdut popularitat des de llavors, tot i que s'ha modificat diverses vegades.
Estructura de la paret cel·lular
La tinció de
Gram revela si un bacteri és Gram positiu o Gram negatiu. La divisió dels bacteris en Gram (+) i Gram (-) es duu a terme d'acord amb l'estructura de la seva paret cel·lular.
La paret cel·lular conté la major quantitat de peptidoglicà (mureïna), una substància complexa, que inclou peptapèptid i glicà. El glicà consisteix en residus alternats de N-acetilglucosamina i àcid N-acetilmuràmic units entre si per β-1,Enllaços 4-glicosídics. El peptidoglicà proporciona manteniment de la forma cel·lular, protecció osmòtica i funcions antigèniques.
Principals diferències entre bacteris Gram-positius i Gram-negatius
Diferents bacteris tenen diferents gruixos de capa de peptidoglicà. En bacteris que es classifiquen com a grampositius, oscil·la entre 15 i 80 nm, mentre que en gramnegatius és de 2 a 8 nm. Al mateix temps, els bacteris Gram-negatius tenen una estructura especial sota la capa de peptidoglicà, que els bacteris Gram positius no tenen: l'espai periplàsmic. Aquest espai està ple d'enzims hidrolítics: β-lactamasa, ribonucleasa 1, fosfatasa. Aquests enzims són els responsables de la resistència dels bacteris gramnegatius a molts antibiòtics.
La capa de peptidoglicà Gram(-) dels bacteris està unida al lipopolisacàrid, una estructura antigènica que conté endotoxina. En els bacteris Gram(+), els àcids teicoics fan funcions similars.
Els bacteris gramnegatius tenen una estructura addicional: la membrana externa.
L'essència del mètode de tinció
Abans de començar a tenyir, es preparen taques dels bacteris estudiats. Per fer-ho, s'aboca aigua sobre un portaobjectes de vidre i s'hi afegeix un cultiu de microorganismes amb un bucle bacterian. Llavors, després que l'aigua s'hagi assecat completament, es fixa el frotis: el portaobjectes de vidre es porta diverses vegades sobre la flama del cremador. La tinció de Gram és més efectiva que la tinció de bacteris vius: les molècules de colorant s'uneixen millor a les cèl·lules mortes.
El color es fa en diverses etapes:
- Es col·loquen trossos petits de paper de filtre sobre un frotis fix i s'aboca el colorant principal: violeta de genciana o blau de metilè.
- Després de 3-5 minuts, traieu el paper de filtre de colors i ompliu el frotis amb la solució de Lugol durant 1 minut. En aquest cas, la preparació s'enfosqueix.
- S'escorre la solució de Lugol i es tracta el frotis amb alcohol etílic pur: s'aboquen unes gotes sobre el preparat, s'escorre al cap de 20 segons. El procediment es repeteix 2-3 vegades.
- Renteu el portaobjectes de prova amb aigua destil·lada.
- Produeix una tinció addicional: acabeu la preparació amb fucsina. Després d'1-2 minuts, el colorant es renta.
- Un cop s'assequi l'aigua, examineu el frotis amb un microscopi. Els bacteris Gram-positius seran blau-violeta, els bacteris Gram-negatius seran de color rosa o vermell.
Causes de diferents patrons de tinció
Tal com s'ha descrit anteriorment, la tinció de Gram dels bacteris tenyeix els bacteris Gram positius de blau-violeta, mentre que els bacteris Gram negatius es tenyeixen de vermell o rosa. El motiu de la tinció diferencial dels bacteris mitjançant aquest mètode és que després que la forma soluble de violeta de genciana entri a la cèl·lula, el colorant passa a la forma de iode insoluble. Durant el tractament de bacteris amb alcohol etílic, els lípids s'extreuen de la membrana sota l'acció d'aquest dissolvent no polar. Aleshores, la membrana es torna porosa i ja no és una barrera important per a la lixiviació del colorant. malgrat aixòEl peptidoglicà és més resistent als dissolvents no polars, inclòs l'alcohol. És ell qui impedeix el rentat del colorant, de manera que els bacteris amb una gruixuda capa de mureïna es tornen blau-violeta (gram-positius) i després del tractament amb alcohol no canvien de color.
La fina capa de mureïna de bacteris gramnegatius no pot contenir les molècules de colorant a la cèl·lula, de manera que després de l'acció de l'alcohol es tornen incolores - es taquen gramnegatives.
Després de l'exposició d'un frotis a la fucsina, els bacteris tenyits de Gram es mantenen en blau-violeta, mentre que els bacteris Gram negatius es tornen de color rosa-vermell.
Exemples de bacteris Gram(+) i Gram(-)
Els bacteris gramnegatius inclouen cianobacteris, bacteris sulfurosos, bacteris del ferro, clamídia, rickettsia, bacteris acètics, molts metilobacteris, bacteris tiònics, arsenitobacteris i carboxibacteris.
Els bifidobacteris, molts bacteris aquàtics, els estreptococs i els estafilococs són grampositius.
