Què hi ha a la base de la hibridació d'ADN? Tot i que la seqüència d'ADN de doble cadena és generalment estable en condicions fisiològiques, canviar aquestes condicions al laboratori (normalment augmentant la temperatura ambient) farà que les molècules es separin en cadenes individuals. Aquests últims són complementaris entre si, però també poden complementar altres seqüències presents al seu entorn. La reducció de la temperatura ambient permet que les molècules monocatenàries s'hibridin o s'hibridin entre elles. Aquest és el mètode d'hibridació d'ADN.
El concepte des del punt de vista de la biologia molecular
Els científics implicats tant en la replicació de l'ADN com en la transcripció d'ADN a ARN es basen en encreuaments de nucleòtids i tècniques de biologia molecular. Això inclou taques Southern i Northern, reacció en cadena de la polimerasa (PCR) i la majoria dels enfocaments de seqüenciació i hibridació ADN-ARN.
Aplicació
La hibridació és la propietat principal dels nucleòtidsseqüències i s'utilitza en nombrosos mètodes de biologia molecular. La relació genètica global de dues espècies es pot determinar mitjançant la hibridació de segments del seu ADN (hibridació ADN-ADN). A causa de les similituds de seqüències entre organismes estretament relacionats, es requereix una temperatura més alta per fondre aquests híbrids d'ADN en comparació amb organismes més llunyans. Diversos mètodes utilitzen la hibridació per determinar l'origen d'una mostra d'ADN, inclosa la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). En un altre mètode, les seqüències d'ADN curtes s'hibriditzen amb l'ARNm cel·lular per identificar els gens expressats. Les empreses farmacèutiques estan explorant l'ús de l'ARN antisentit per unir-se a l'ARNm no desitjat, evitant que el ribosoma tradueixi l'ARNm a proteïna.
La hibridació ADN-ADN es refereix generalment a una tècnica de biologia molecular que mesura el grau de similitud genètica entre grups de seqüències d'ADN. S'utilitza habitualment per determinar la distància genètica entre dos organismes. S'ha utilitzat àmpliament en filogènia i taxonomia.
Metodologia
Es va etiquetar
ADN d'un organisme i després es va barrejar amb ADN no marcat que es podia comparar amb ell. La mescla s'incuba per permetre que les cadenes d'ADN es dissociïn i després es refredin per formar un ADN de doble cadena híbrid regenerat. Les seqüències hibridades amb un alt grau de similitud s'uniran més fortament i requeriran més energia per separar-les: és a dir, es separen quan s'escalfen a una temperatura més alta.temperatura que seqüències diferents, un procés conegut com a "fusió de l'ADN".
Fusió de l'ADN
Avaluant el perfil de fusió de l'ADN hibridat, l'ADN de doble cadena s'uneix a una anomenada "columna" i la mescla resultant s'escalfa. A cada pas, la columna es renta i les seqüències d'ADN que es fonen es tornen monocatenaris i es renten de la columna. Les temperatures a les quals l'ADN marcat surt de la columna reflecteixen la quantitat de similitud entre seqüències (i el patró d'autoplegament serveix de control). Aquests resultats es combinen per determinar el grau de similitud genètica entre organismes. Segons la microbiologia moderna, la hibridació d'ADN és impossible sense comprendre aquestes coses.
Quan es comparen d'aquesta manera diverses espècies d'àcid ribonucleic (o desoxiribonucleic), els valors de semblança permeten col·locar les espècies a l'arbre filogenètic. Per tant, aquest és un dels possibles enfocaments per dur a terme la sistemàtica molecular. Charles Sibley i John Ahlquist, els pioners d'aquesta tècnica, van utilitzar la hibridació ADN-ADN per estudiar les relacions filogenètiques dels ocells (taxonomia Sibley-Ahlquist) i els primats.
Importància per a la biologia
La hibridació ADN-ADN és l'estàndard d'or per distingir espècies bacterianes, amb un valor de similitud superior al 70%, cosa que indica que les soques comparades pertanyen a espècies diferents. El 2014, es va proposar un llindar del 79% de semblança per separar una subespècie bacteriana.
Els crítics afirmen que la tècnica és inexacta per comparar espècies estretament relacionades, ja que qualsevol intent de mesurar diferències entre seqüències ortòlogues entre organismes es veu desbordat per la hibridació de homòlegs paràlegs en el genoma d'un organisme. La seqüenciació d'ADN i les comparacions de seqüències computacionals són actualment el mètode d'ús habitual per determinar la distància genètica, tot i que aquest enfocament encara s'utilitza en microbiologia per ajudar a identificar bacteris.
La manera actual és realitzar la hibridació ADN-ADN en silicona mitjançant genomes seqüenciats totalment o parcialment. El GGDC desenvolupat pel DSMZ és l'eina coneguda més precisa per calcular valors semblants a DDH. Entre altres millores algorítmiques, resol el problema de les seqüències paralogues filtrant-les acuradament de les coincidències entre dues seqüències del genoma.
Mètode FISH
La hibridació de fluorescència in situ (FISH) és una tècnica de laboratori que s'utilitza per detectar i seqüenciar l'ADN, sovint en un cromosoma específic.
El 1969, Joseph Gall i Mary Lou Pardu van publicar un article que demostrava que les còpies radioactives d'una seqüència d'ADN ribosòmic es podrien utilitzar per detectar seqüències d'ADN complementàries al nucli d'un ou de granota. Des d'aquestes observacions originals, molts refinaments han augmentat la versatilitat ila sensibilitat del procediment fins a tal punt que la hibridació in situ ("al lloc", en llatí) es considera ara una eina important en citogenètica. (El terme in situ també s'utilitza ara per referir-se a l'etapa inicial del creixement del carcinoma, quan només el teixit epitelial està implicat en el procés patològic.)
Seqüència d'hibridació fluorescent
Les sondes d'ARN
es poden dissenyar per a qualsevol gen o qualsevol seqüència d'un gen per visualitzar l'ARNm de lncRNA i miRNA en teixits i cèl·lules. FISH s'utilitza per estudiar el cicle de reproducció cel·lular, en particular la interfase nuclear per a qualsevol anomalia cromosòmica. FISH us permet analitzar una gran sèrie de casos d'arxiu, és molt més fàcil identificar el cromosoma identificat mitjançant la creació d'una sonda amb una base cromosòmica artificial que atraurà cromosomes similars.
Señals d'hibridació per a cada sonda quan es detecta una anormalitat nuclear: cada sonda de detecció d'ARNm i lncRNA consta de 20 parells d'oligonucleòtids, cada parell cobreix un espai de 40-50 pb. p. Les sondes utilitzen química patentada per detectar l'ARNm.
Hibridació amb sondes d'ADN
Les sondes sovint es fan a partir de fragments d'ADN que s'han aïllat, purificat i amplificat per utilitzar-los en el disseny del genoma humà. La mida del genoma humà és tan gran en comparació amb la longitud que es pot seqüenciar directament que cal dividir-lo enfragments. Finalment, aquests fragments es van ordenar digerint una còpia de cada fragment en unitats encara més petites utilitzant endonucleases específiques de seqüència per mesurar la mida de cada fragment petit mitjançant cromatografia d'exclusió de mida utilitzant aquesta informació per determinar on es superposaven els fragments grans entre si..
Per preservar els elements amb les seves seqüències individuals d'ADN, els fragments es van afegir a un sistema de poblacions bacterianes que es repeteixen. Les poblacions clonals de bacteris, cada població que manté un únic cromosoma artificial, s'emmagatzemen en diversos laboratoris d'arreu del món. Els cromosomes artificials (BAC) es poden cultivar, extreure i etiquetar en qualsevol laboratori que contingui una biblioteca. Les biblioteques genòmiques sovint reben el nom de les institucions on es van desenvolupar. Un exemple és la biblioteca RPCI-11, que porta el nom del Roswell Cancer Institute de Buffalo (Nova York, EUA). Aquests fragments constitueixen uns 100 mil parells de bases i són la base de la majoria de les sondes FISH.
