L'absorció i la reemissió addicional de llum per mitjans inorgànics i orgànics és el resultat de la fosforescència o fluorescència. La diferència entre els fenòmens és la longitud de l'interval entre l'absorció de llum i l'emissió del corrent. Amb la fluorescència, aquests processos es produeixen gairebé simultàniament, i amb la fosforescència, amb cert retard.
Antecedents històrics
El 1852, el científic britànic Stokes va descriure per primera vegada la fluorescència. Va encunyar el nou terme com a resultat dels seus experiments amb espat fluor, que emetia llum vermella quan s'exposava a la llum ultraviolada. Stokes va observar un fenomen interessant. Va trobar que la longitud d'ona de la llum fluorescent és sempre més llarga que la de la llum d'excitació.
Al segle XIX es van fer molts experiments per confirmar la hipòtesi. Van demostrar que una varietat de mostres fluoresc quan s'exposen a la llum ultraviolada. Els materials inclouen, entre d' altres, cristalls, resines, minerals, clorofil·la,matèries primeres medicinals, compostos inorgànics, vitamines, olis. L'ús directe de colorants per a l'anàlisi biològica va començar només el 1930
Descripció de la microscòpia de fluorescència
Alguns dels materials utilitzats en la investigació de la primera meitat del segle XX eren molt específics. Gràcies a indicadors que no s'han pogut aconseguir amb mètodes de contrast, el mètode de la microscòpia de fluorescència s'ha convertit en una eina important tant en la investigació biomèdica com en la biològica. Els resultats obtinguts van ser de no poca importància per a la ciència dels materials.
Quins són els beneficis de la microscòpia de fluorescència? Amb l'ajuda de nous materials, va ser possible aïllar cèl·lules molt específiques i components submicroscòpics. Un microscopi fluorescent permet detectar molècules individuals. Una varietat de colorants us permet identificar diversos elements al mateix temps. Encara que la resolució espacial de l'equip està limitada pel límit de difracció, que, al seu torn, depèn de les propietats específiques de la mostra, la detecció de molècules per sota d'aquest nivell també és molt possible. Diverses mostres presenten autofluorescència després de la irradiació. Aquest fenomen s'utilitza àmpliament en petrologia, botànica i indústria de semiconductors.
Característiques
L'estudi de teixits animals o microorganismes patògens sovint es complica amb una autofluorescència inespecífica massa feble o molt forta. No obstant això, el valor enla investigació adquireix la introducció en el material de components excitats a una determinada longitud d'ona i que emeten un flux de llum de la intensitat requerida. Els fluorocroms actuen com a colorants capaços d'unir-se a les estructures (invisibles o visibles). Al mateix temps, es distingeixen per una alta selectivitat pel que fa als objectius i el rendiment quàntic.
La microscòpia de fluorescència s'ha utilitzat àmpliament amb l'arribada dels colorants naturals i sintètics. Tenien perfils específics d'emissió i intensitat d'excitació i estaven dirigits a dianes biològiques específiques.
Identificació de molècules individuals
Sovint, en condicions ideals, podeu registrar la brillantor d'un sol element. Per fer-ho, entre altres coses, cal garantir un soroll del detector i un fons òptic prou baix. Una molècula de fluoresceïna pot emetre fins a 300.000 fotons abans de la destrucció a causa del fotoblanqueig. Amb una taxa de recollida del 20% i l'eficiència del procés, es poden registrar per un import d'uns 60 mil
La microscòpia de fluorescència, basada en fotodíodes d'allaus o multiplicació d'electrons, va permetre als investigadors observar el comportament de les molècules individuals durant segons i, en alguns casos, minuts.
Dificultats
El problema clau és la supressió del soroll del fons òptic. A causa del fet que molts dels materials utilitzats en la construcció de filtres i lents presenten certa autofluorescència, els esforços dels científics en les etapes inicials es van centrar a emetrecomponents amb baixa fluorescència. Tanmateix, els experiments posteriors van portar a noves conclusions. En particular, s'ha trobat que la microscòpia de fluorescència basada en la reflexió interna total aconsegueix un fons baix i una sortida de llum d'excitació elevada.
Mecanisme
Els principis de la microscòpia de fluorescència basats en la reflexió interna total són utilitzar una ona que es desintegra ràpidament o no es propaga. Sorgeix a la interfície entre mitjans amb diferents índexs de refracció. En aquest cas, el feix de llum passa per un prisma. Té un alt índex de refracció.
El prisma és adjacent a una solució aquosa o un vidre de paràmetres baixos. Si el feix de llum s'hi dirigeix en un angle que és més gran que el crític, el feix es reflecteix completament des de la interfície. Aquest fenomen, al seu torn, dóna lloc a una ona no propagadora. En altres paraules, es genera un camp electromagnètic que penetra un medi amb un índex de refracció més baix a una distància inferior a 200 nanòmetres.
En una ona no propagadora, la intensitat de la llum serà prou suficient per excitar els fluoròfors. Tanmateix, a causa de la seva profunditat excepcionalment poca, el seu volum serà molt petit. El resultat és un fons de baix nivell.
Modificació
La microscòpia de fluorescència basada en la reflexió interna total es pot realitzar amb epi-il·luminació. Això requereix lents amb una obertura numèrica més gran (almenys 1,4, però és desitjable que arribi a 1,45-1,6), així com un camp parcialment il·luminat de l'aparell. Aquest últim s'aconsegueix amb un petit punt. Per a una major uniformitat, s'utilitza un anell prim, a través del qual es bloqueja part del flux. Per obtenir un angle crític després del qual es produeix la reflexió total, cal un alt nivell de refracció del medi d'immersió a les lents i al vidre de la coberta del microscopi.
