Els mètodes d'investigació biològica molecular tenen un paper important en la medicina moderna, la medicina forense i la biologia. Gràcies als avenços en l'estudi de l'ADN i l'ARN, una persona és capaç d'estudiar el genoma d'un organisme, determinar l'agent causant d'una mal altia, reconèixer l'àcid nucleic desitjat en una barreja d'àcids, etc.
Mètodes d'investigació biològica molecular. Què és?
Als anys 70 i 80, els científics van aconseguir per primera vegada desxifrar el genoma humà. Aquest esdeveniment va donar impuls al desenvolupament de l'enginyeria genètica i la biologia molecular. L'estudi de les propietats de l'ADN i l'ARN ha portat al fet que ara és possible utilitzar aquests àcids nucleics per diagnosticar una mal altia, estudiar gens.
Obtenció d'ADN i ARN
Els mètodes de diagnòstic biològic molecular requereixen la presència de material de partida: més sovint són àcids nucleics. Hi ha diverses maneres d'aïllar aquestes substàncies de les cèl·lules dels organismes vius. Cadascun d'ells té els seus propis avantatges i desavantatges, i és necessaritenir en compte a l'hora de triar un mètode per aïllar els àcids nucleics purs.
1. Obtenció d'ADN segons Marmur. El mètode consisteix a tractar una mescla de substàncies amb alcohol, com a resultat del qual precipita l'ADN pur. El desavantatge d'aquest mètode és l'ús de substàncies agressives: fenol i cloroform.
2. Aïllament d'ADN segons Boom. La principal substància que s'utilitza aquí és el tiocianat de guanidina (GuSCN). Contribueix a la precipitació de l'àcid desoxiribonucleic sobre substrats especialitzats, dels quals es pot recollir posteriorment mitjançant un tampó especial. No obstant això, GuSCN és un inhibidor de la PTC, i fins i tot una petita part que entra a l'ADN precipitat pot afectar el curs de la reacció en cadena de la polimerasa, que té un paper important en el treball amb els àcids nucleics.
3. Sedimentació d'impureses. El mètode es diferencia dels anteriors en què no són les molècules d'àcid desoxiribonucleic les que es precipiten, sinó les impureses. Per fer-ho, s'utilitzen intercanviadors d'ions. El desavantatge és que no totes les substàncies poden precipitar.
4. Projecció massiva. Aquest mètode s'utilitza en els casos en què no es necessita informació exacta sobre la composició de la molècula d'ADN, però sí que cal obtenir algunes dades estadístiques. Això s'explica pel fet que l'estructura de l'àcid nucleic es pot danyar quan es tracta amb detergents, en particular àlcalis.
Classificació dels mètodes de recerca
Tots els mètodes d'investigació biològica molecular es divideixen en tres grans grups:
1. Amplificació (utilitzant molts enzims). Aquíes refereix a la PCR - reacció en cadena de la polimerasa, que té un paper important en molts dels mètodes de diagnòstic.
2. No amplificador. Aquest grup de mètodes està directament relacionat amb el funcionament de mescles d'àcids nucleics. Alguns exemples són 3 taques, hibridació in situ, etc.
3. Mètodes basats en el reconeixement d'un senyal d'una molècula de sonda que s'uneix a una sonda específica ADN o ARN. Un exemple és el sistema de captura híbrid (hc2).
Enzims que es poden utilitzar en mètodes de recerca en biologia molecular
Molts mètodes de diagnòstic molecular impliquen l'ús d'una àmplia gamma d'enzims. A continuació es mostren els més utilitzats:
1. Enzim de restricció: "talla" la molècula d'ADN en les parts necessàries.
2. ADN polimerasa: sintetitza una molècula de doble cadena d'àcid desoxiribonucleic.
3. Transcriptasa inversa (revertasa): s'utilitza per sintetitzar ADN en una plantilla d'ARN.
4. ADN lligasa: responsable de la formació d'enllaços fosfodièster entre nucleòtids.
5. Exonucleasa: elimina els nucleòtids de les seccions terminals de la molècula d'àcid desoxiribonucleic.
PCR és el mètode principal d'amplificació d'ADN
La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) s'utilitza activament en la biologia molecular moderna. Aquest és un mètode en el qual es poden obtenir un gran nombre de còpies d'una sola molècula d'ADN (les molècules s'amplifiquen).
Funcions principals de la PCR:
- diagnòsticmal alties;
- clonació de segments d'ADN, gens.
Per dur a terme una reacció en cadena de la polimerasa es requereixen els elements següents: la molècula inicial d'ADN, una ADN polimerasa termoestable (Taq o Pfu), desoxiribonucleòtids fosfats (fonts de bases nitrogenades), cebadors (2 cebadors per 1 molècula d'ADN).) i el propi sistema tampó, en el qual totes les reaccions són possibles.
La PCR consta de tres passos: desnaturalització, recuit d'imprimació i allargament.
1. Desnaturalització. A una temperatura de 94-95 graus centígrads, els enllaços d'hidrogen entre les dues cadenes d'ADN es trenquen i, com a resultat, obtenim dues molècules monocatenaris.
2. Primer recuit. A una temperatura de 50-60 graus centígrads, els cebadors s'uneixen als extrems de les molècules d'àcid nucleic monocatenari pel tipus de complementarietat.
3. Elongació. A una temperatura de 72 graus, es produeix la síntesi de molècules filles de doble cadena d'àcid desoxiribonucleic.
Seqüenciació d'ADN
Els mètodes d'investigació biològica molecular sovint requereixen el coneixement de la seqüència de nucleòtids en una molècula d'àcid desoxiribonucleic. Es realitza la seqüenciació per determinar el codi genètic. El diagnòstic molecular del futur es basarà en el coneixement obtingut de la seqüenciació humana.
Es distingeixen els següents tipus de seqüenciació:
- Seqüenciació de Maxam-Gilbert;
- Seqüenciació Sanger;
- piroseqüenciació;
- nanoporeseqüenciació.
